Enzim Restriksi
Asam nukleat baik DNA maupun RNA mampu dipotong dengan menggunakan suatu enzim yaitu nuklease. Enzim nuklease yang mampu memotong RNA disebut ribonuklease atau Rnase, sementara enzim yang mampu memotong DNA disebut deoksiribonuklease atau Dnase. Beberapa nuklease hanya memotong urutan asam nukleat yang single strand dan apa pula yang mampu memotong asam nukleat yang double strand. Nuklease ada dua macam yakni eksonuklease yang mampu memotong molekul asam nukleat single strand atau beberapa oligonukleotida pendek yang hanya mengenali salah satu ujung asam nukleat, yaitu ujung 5′ atau ujung 3′; sementara endonuklease mampu memotong asam nukleat di dareah tengah daru sekuens asam nukleat yang mampu mengenali daerah spesifik pada urutan asam nukleat (Clark, 2010; Howe, 2007; Murray et al., 2009).
Salah tujuan untuk memperoleh suatu
daerah DNA dalam suatu genom adalah untuk melakukan perbanyakan (kloning).
Untuk memperoleh suatu urutan DNA tersebut maka dilakukan pemotongan genom DNA
menjadi fragmen-fragmen dengan menggunakan enzim tertentu yang mampu memotong
ikatan fosfodiaeter pada untaian DNA tersebut yakni berupa enzim restriksi.
Enzim restriksi yang diproduksi oleh
bakteri dinamakan endonuklease yang secara tipikal mampu mengenali 4 – 8 bp
urutan nukleotida yang spesifik. Urutan nukleotida yang spesifik tersebut
dinamakan restriction sites yang secara umum merupakan sekuens palindromic
(run back) yang pendek dengan pola urutan sekuens yang sama ketika
dibaca pada arah 5′ → 3′ (Howe, 2007; Lodish
et al., 2003; Ream et al., 2003). Pada Gambar1 ditunjukkan enzim EcoRI
yang mampu mengenali enam urutan nukleotida spesifik yang kemudian dipotong menjadi
dua. Sementara beberapa contoh enzim restriksi dengan daerah spesifikny
disajikan pada Tabel 1.
Gambar
1. Suatu double strand dari DNA yang dipotong oleh enzim
restriksi EcoRI (Lodge et al., 2007).
Tabel 1. Beberapa
contoh endonuklease dengan daerah spesifiknya (Lehninger et al., 2000).
Enzim restriksi endonuklease dibagi
menjadi tiga tipe dengan karakteristik yang berbeda-beda dan disajikan dalam
Tabel 2.
Tabel 2. Karakteristik
dari masing-masing tipe endonuklease (Howe, 2007; Reece, 2004).
Adapun cara kerja enzim endonuklease
tersebut berbeda-beda. Enzim endonuklease tipe II telah diketahui strukturalnya
yang sisi katalitiknya tersusun atas 5 macam protein sekunder dalam bentuk
β-sheet yang diapit oleh 2 protein sekunder dalam bentuk α-heliks (Gambar 2).
Enzim restriksi endonuklease tersebut dapat melakukan ‘scanning’ pada untain
molekul DNA jika tidak menemukan restriction sites yang spesifik.
Peristiwa tersebut dinamakan mekanisme sliding. Mekanisme sliding tersebut melibatkan pergerakan di sepanjang
lekukan DNA. Namun enzim
restriksi endonuklease tersebut akan mengubah konformasinya ketika mengenali
daerah restriction sites yang spesifik. Ketika sudah mengenali daerah
spesifik, maka enzim tersebut akan memotong dua ikatan gula deoksiribosa dengan
fosfat dari double helix DNA yang berbeda dan menghasilkan gugus 3′
hidroksil (OH) dan gugus 5′ fosfat (PO4-). Selanjutnya
DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai dengan daerah pemotongannya.
Enzim endonuklease tidak selamanya memotong DNA menjadi fragmen yang ujungnya
simetris (blunt ends), namun ada juga yang ujungnya asimetris (sticky
ends) (Gambar 3). Pola potongan simetris atau tidaknya tergantung kinerja enzim
endonuklease seperti yang tertera pada Tabel 1(Allison, 2007; Reece, 2004).
Gambar
2. Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim
tersebut mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik
5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G.
Hasilnya adalah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends. Pada
gambar tersebut warna hijau dan biru menunjukkan subunit protein dimer yang
identik (Reece, 2007).
Gambar
3. Contoh pola pemotongan enzim restriksi endonuklease. Enzim
tersebut menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan formasi 5′–PO4–
dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends (BamHI)
dan bentuk simetris atau blunt ends (SmaI) (Allison, 2007).
Enzim BamHI ini memiliki
kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam prosedur protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl
tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk
meningkatkan aktivitas enzim restriksi (Ausubel, 2003; Reece, 2004). Adapun
kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatan fosfodiester pada
urutan DNA pada sisi:
5′ G↓G-A-T-C-C 3′
3′ C-C-T-A-G↑G 5′
Enzim restriksi tersebut mampu
mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G), sehingga BamHI disebut juga
sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh enzim BamHI berupa
formasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya
berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel, 2003; Becker et al.,
1996).
Enzim BamHI bekerja dengan
cara melakukan scanning sekuens non-spesifik di sepanjang DNA dengan
cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim tersebut menemukan
sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa konformasinyan dan
sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida
G menjadi fragmen yang terpisah (Allison, 2007).
Sumber : Generasi Biologi
Komentar
Posting Komentar